泪液基质金属蛋白酶9免疫测定与干眼症体征和症状的相关性：一项采用定性、半定量和定量策略的横断面研究

摘 要

目 的 本 研 究 旨 在 通 过 定 性 、 半 定 量 和 定 量 评 估 免 疫 印 迹 条 带 ， 分 析 泪 液 基 质 金 属 蛋 白 酶 9 （ MMP-9） 免 疫 测 定 与 干 眼 症 （ DE） 体 征 和 症 状 严 重 程 度 之 间 的 关 联 。

材 料 与 方 法 本 横 断 面 研 究 纳 入 了 320 名 患 者 的 320 只 眼 。 通 过 眼 表 疾 病 指 数 （ OSDI） 评 分 、 视 觉 模 拟 量 表 （ VAS） 、 泪 膜 破 裂 时 间 （ tBUT） 、 泪 河 高 度 测 量 评 估 泪 液 量 以 及 牛 津 分 级 方 案 对 角 膜 和 结 膜 的 染 色 评 分 来 评 估 干 眼 症 的 临 床 体 征 。 泪 液 中 MMP-9 免 疫 测 定 结 果 通 过 定 性 （ 阳 性 或 阴 性 ） 、 半 定 量 （ 试 剂 条 带 密 度 采 用 四 点 量 表 ： 0 = 阴 性 ； 1 = 弱 阳 性 ； 2 = 中 度 阳 性 ； 3 = 强 阳 性 ） 和 定 量 （ 试 剂 条 带 密 度 与 对 照 条 带 密 度 的 比 值 ） 指 标 进 行 解 读 。

结 果 MMP-9 免 疫 测 定 阳 性 结 果 与 泪 膜 破 裂 时 间 （ tBUT） 较 短 、 tBUT 不 足 3 秒 、 角 膜 染 色 评 分 较 高 、 角 膜 染 色 评 分 ≥ 2 分 以 及 结 膜 染 色 评 分 ≥ 2 分 显 著 相 关 。 MMP-9 免 疫 测 定 的 半 定 量 结 果 与 较 高 的 角 膜 染 色 评 分 呈 正 相 关 （ r = 0.122， p = 0.029） ， 与 tBUT 呈 负 相 关 （ r = - 0.125， p = 0.025） 。 然 而 ， 在 定 量 分 析 中 ， DE 的 任 何 体 征 或 症 状 均 与 MMP-9 免 疫 测 定 的 条 带 密 度 无 关 。

结 论 MMP-9 免 疫 测 定 的 阳 性 结 果 与 干 眼 症 （ DE） 眼 部 体 征 的 严 重 程 度 有 关 。 然 而 ， 利 用 MMP-9 免 疫 测 定 的 定 量 指 标 来 评 估 干 眼 症 的 临 床 严 重 程 度 ， 还 需 要 进 一 步 的 研 究 。

介绍 干眼症 （ DE）是一种多因素导致的泪液和眼表疾病，会导致视觉障碍和泪膜 不稳定，对日常生活、情绪健康和工作能力产生负面影响 [1, 2]。通常，评估 干眼症的临床严重程度时，会通过使用不同类型的干眼症问卷，如美国国家 眼科研究所视觉功能问卷 -25、眼表疾病指数 （ OSDI） 、标准患者眼干评估问 卷等，来评估患者的主观症状 [3-5]。此外，还会通过施墨试验、泪膜破裂时 间 （ tBUT） 、角膜和结膜的荧光素或丽丝胺绿染色评分以及睑板腺评估等方 法来评估临床体征 [6, 7]。最近，炎症已被报道为干眼症发病的核心机制之一 [8]。鉴于这些新发现的核心机制，泪液高渗和泪液基质金属蛋白酶 9（ MMP- 9）水平升高被列为干眼症的诊断指标：泪液渗透压 ＞ 300 毫渗量 /升或双眼间 差值 ＞ 8 毫渗量 /升被视为失去稳态，可使用 TearLab 渗透压仪（美国加利福 尼亚州圣地亚哥）进行检测 [9, 10]。 MMP-9 由眼表上皮细胞分泌，正常情况 下泪液中的浓度低于 40 纳克 /毫升 [11]。干眼症的 炎症 过程会促使 MMP-9 释 放，使其在泪液中的浓度升高 [12]。 InflammaDry（美国加利福尼亚州圣地亚 哥的奎 德尔公司）是一种新开发的诊断工具，能够检测泪液中浓度 ＞ 40 纳克 / 毫升的 MMP-9[13-15]。

为 了 验 证 这 种 新 型 的 MMP-9 点 检 免 疫 测 定 法 ， 进 行 了 多 项 研 究 。 这 些 研 究 大 多 侧 重 于 将 定 性 检 测 结 果 与 干 眼 症 （ DE） 的 临 床 症 状 和 体 征 进 行 比 较 。 Messmer 等 人 [16]报 告 称 ， 泪 膜 破 裂 时 间 （ tBUT） 缩 短 、 严 重 的 睑 板 腺 功 能 障 碍 （ MGD） 、 眼 表 染 色 以 及 Schirmer 试 验 结 果 低 ， 均 与 MMP-9 检 测 阳 性 显 著 相 关 。 Chotikavanich 等 人 [17]提 到 ， MMP-9 阳 性 与 症 状 严 重 程 度 评 分、地 形 图 表 面 规 则 性 指 数 、 结 膜 和 角 膜 荧 光 素 染 色 评 分 以 及 tBUT 显 著 相 关。

先 前 的 一 项 研 究 报 道 ， MMP-9 浓 度 与 泪 液 渗 透 压 和 Schirmer 试 纸 条 体 积 存 在 相 关 性 [18]。 Park 等 人 [19]也 证 明 了 干 眼 症 症 状 与 半 定 量 MMP-9 分 级 之 间 存 在 良 好 的 相 关 性 。 此 外 ， 我 们 之 前 的 研 究 表 明 ， 在 实 验 条 件 下 ， InflammaDry 的 条 带 密 度 与 MMP-9 浓 度 成 正 比 增 加 [20]。 因 此 ， 我 们 想 要 探 究 强 条 带 密 度 是 否 与 干 眼 症 体 征 和 症 状 的 严 重 程 度 有 关 。 而 且 ， 据 我 们 所 知 ， 关 于 定 量 MMP-9 免 疫 测 定 测 试 结 果 与 干 眼 症 临 床 严 重 程 度 之 间 关 系 的 研 究 尚 属 空 白 。 因 此 ， 本 研 究 旨 在 确 定 使 用 定 性 （ 阳 性 或 阴 性 ） 、 半 定 量 （ 试 剂 条 带 密 度 采 用 四 点 量 表 ： 0 = 阴 性 ； 1 = 弱 阳 性 ； 2 = 中 度 阳 性 ； 3 = 强 阳 性 ） 和 定 量 （ 试 剂 条 带 密 度 与 对 照 条 带 密 度 的 比 值 ） 指 标 解 读 的 MMP-9 免 疫 测 定 结果 与 干 眼 症 临 床 体 征 和 症 状 之 间 的 相 关 性 。

材 料 与 方 法

研 究 设 计 与 研 究 环 境

这 项 横 断 面 研 究 纳 入 了 2017 年 4 月 1 日 至 2018 年 10 月 1 日 期 间 在 我 院 眼 科 就 诊 的 320 名 患 者 。 该 研 究 遵 循 《 赫 尔 辛 基 宣 言 》 的 原 则 ， 并 获 得 了 庆 明 大 学 东 山 医 院 机 构 审 查 委 员 会 的 批 准 （ IRB 编 号 ： 2017-06-008） 。 患 者 签 署 了 使 用 其 数 据 的 知 情 同 意 书 。 研 究 者 从 每 位 入 组 患 者 的 右 眼 收 集 了 临 床 数 据 和 MMP-9检 测 结 果 。

临 床 评 估 结 果 及 收 集 的 数 据

纳 入 标 准 。 以 眼 干 、 刺 痛 、 烧 灼 感 和 /或 眼 痒 等 干 眼 症 症 状 为 主 诉 ， 且 符 合 以 下 四 项 标 准 之 一 的 患 者 被 纳 入 研 究 ： 眼 表 疾 病 指 数 （ OSDI） 评 分 ＞ 20 分 、 泪 膜 破 裂 时 间 （ tBUT） ＜ 5 秒 、 无 麻 醉 泪 膜 破 裂 时 间 测 试 结 果 ＜ 5 毫 米 /5 秒 、 角 膜 荧 光 素 染 色 结 果 ≥ 1 分 。 采 用 这 些 标 准 ， 我 们 尽 量 排 除 了 轻 度 干 眼 症 患 者 。 临 床 评 估 按 以 下 顺 序 进 行 ： OSDI 问 卷 /视 觉 模 拟 量 表 （ VAS） 评 分 、 泪 膜 破 裂 时 间 测 定 、 泪 液 基 质 金 属 蛋 白 酶 -9（ MMP-9） 免 疫 测 定 、 tBUT、 角 膜 和 结 膜 染 色 评 分 ， 以 及 滴 用 丙 美 卡 因 （ 帕 瑞 卡 因 ； 韩 美 制 药 ， 韩 国 首 尔 ） 后 睑 板 腺 评 估 。 排 除 患 有 活 动 性 眼 部 感 染 、 妊 娠 期 妇 女 或 存 在 泪 道 引 流 障 碍 （ 如 泪 小 点 狭 窄 、 泪 小 点 畸 形 、 泪 小 管 异 常 、 鼻 泪 管 阻 塞 ） 的 患 者 ； 以 及 在 1 个 月 内 接 受 过 局 部 或 全 身 皮 质 类 固 醇 治 疗 或 免 疫 调 节 治 疗 的 患 者 ； 对 荧 光 素 过 敏 、 玉 米 淀 粉 或 涤 纶 过 敏 、 6 个 月 内 接 受 过 眼 部 手 术 或 3 个 月 内 有 眼 部 创 伤 者 ， 以 及 72 小 时 内 佩 戴 过 隐 形 眼 镜 者 均 被 排 除 在 外 。

主 观 症 状 。 患 者 接 受 了 全 面 的 眼 科 检 查 。 使 用 OSDI 问 卷 [4]对 主 观 症 状 进 行 测 量 。 OSDI 评 分 范 围 为 0 至 100 分 ， 其 中 0 分 表 示 无 残 疾 ， 100 分 表 示 完 全 残 疾 。 使 用 视 觉 模 拟 评 分 法 （ VAS） 记 录 眼 部 疼 痛 的 程 度 ， 其 中 0 分 表 示 无 痛 ， 10 分 表 示 最 剧 烈 的 疼 痛 [21]。

泪 液 量 评 估 的 泪 液 弯 月 面 测 量 法 。 使 用 泪 液 弯 月 面 测 量 仪 （ Echo Electricit y Co., Ltd.， 福 岛 ， 日 本 ） 测 量 泪 液 量 。 自 愿 眨 眼 2 至 3 次 后 ， 将 泪 液 弯 月 面 测 量 仪 的 探 头 置 于 下 眼 睑 泪 湖 外 侧 三 分 之 一 区 域 5 秒 钟 。 泪 液 量 以 染 色 泪 柱 的 长 度 （ 毫 米 ） 记 录 。

泪 液 基 质 金 属 蛋 白 酶 9（ MMP-9） 即 时 检 测 。 泪 液 MMP-9 免 疫 测 定 （ InflammaDry） 检 测 由 一 名 检 查 员 （ JHJ） 按 照 制 造 商 的 说 明 进 行 操 作 。 为 采 集 泪 液 样 本 ， 样 本 收 集 器 在 下 睑 结 膜 的 三 个 不 同 位 置 （ 颞 侧 、 中 间 、 鼻 侧 ； 从 鼻 侧 到 颞 侧 方 向 ） 各 轻 触 三 次 ， 然 后 在 颞 侧 下 睑 结 膜 处 再 放 置 5 秒 。 之 后 ， 将 样 本 收 集 器 折 入 测 试 盒 中 。 5 秒 后 ， 将 吸 水 尖 端 浸 入 缓 冲 液 中 。 在 相 同 条 件 下 评 估 测 试 线 结 果 带 的 密 度 ， 在 测 试 开 始 20 分 钟 后 ， 使 用 装 有 单 镜 头 反 光 相 机 （ 佳 能 EOS 700D， 设 置 ： 感 光 度 400， 快 门 速 度 1/200 秒 ； 佳 能 美 国 公 司 ， 纽 约 州 梅 尔 维 尔 ） 的 裂 隙 灯 显 微 镜 拍 摄 结 果 窗 口 的 照 片 。 测 试 结 果 通 过 定 性 、 半 定 量 和 定 量 进 行 解 读 。 定 性 分 析 采 用 两 点 量 表 ： 0 = 阴 性 ， 1 = 阳 性 。 结 果 为当除了淡色条带外还有其他条带时，即视为检测结果呈阳性。由一名临床医生（ JHJ） 根据检测线（红色）的颜色强度进行半定量分析，采用四分制 ： 0 分为阴性 ； 1 分为 弱阳性 ； 2 分为中度阳性 ； 3 分为强阳性（ 图 1） 。使用 ImageJ 1.44p 版本（美国马 里兰州贝塞斯达市国立卫生研究院） 由三位不同的实验人员 （ YHL、 M-JS 和 HK） 对红色条带的密度进行定量分析 [22]。首先，将检测结果的图像导入 ImageJ 软件 ， 并转换为 8 位颜色。其次，绘制一个包含试剂条带和对照条带的正方形。第三，选 择第一个泳道，然后在分析工具中选择绘制泳道。第四，检查两个峰值点，并绘制 构成最理想抛物线的两条线。最后，选择魔棒工具，点击代表试剂（ 图 2a）和对照 条带（ 图 2b）密度的区域。定量结果通过 ImageJ 中试剂条带密度与对照条带密度的比值计算得出。 解读这些结果的临床医生并不了解患者的临床特征。

但 对 泪 膜 破 裂 时 间 （ tBUT） 的 评 估 是 通 过 湿 润 的 荧 光 素 试 纸 （ 瑞 士 哈 格 -斯 特 里 特 公 司 ， 科 尼 茨 ） 触 碰 下 泪 小 点 颞 侧 球 结 膜 来 完 成 的 。 患 者 被 指 示 眨 眼 ， 然 后 在 蓝 光 照 明 下 通 过 生 物 显 微 镜 （ 放 大 倍 数 为 10 倍 ） 和 秒 表 记 录 从 最 后 一 次 眨 眼 到 泪 膜中 首 次 出 现 暗 斑 的 时 间 间 隔。

角 膜 和 结 膜 染 色 评 分 。 通 过 向 泪 膜 滴 入 荧 光 素 进 行 角 膜 和 结 膜 染 色 ， 并 使 用 牛 津 评 分 法 测 量 评 分 。

评 分 方 案 。 染 色 程 度 依 据 一 系 列 面 板 （ A - E） 上 的 点 数 来 确 定 ； 每 个 面 板 的 染 色 评 分 范 围 为 0 至 5 分 ， 暴 露 的 睑 裂 结 膜 和 角 膜 的 总 分 范 围 为 0 至 15 分 [23]。 对 右 眼 鼻 侧 和 颞 侧 的 结 膜 染 色 评 分 进 行 测 量 ， 并 将 总 分 用 于 相 关 性 分 析 。 睑 板 腺 评 估 。 睑 板 腺 功 能 障 碍 （ MGD） 根 据 其 分 泌 物 的 混 浊 度 和 可 挤 出 性 进 行 评 估 。 混 浊 度 分 为 0 至 3 级 ： 清 澈 = 0； 混 浊 = 1； 颗 粒 状 = 2； 浓 稠 = 3。 可 挤 出 性 在 局 部 麻 醉 后 进 行 评 估 ， 分 为 0 至 3 级 ： 0 = 分 泌 物 清 澈 且 容 易 挤 出 ； 1 = 分 泌 物 混 浊 ， 需 轻 度 按 压 才 能 挤 出 ； 2 = 分 泌 物 浓 稠 混 浊 ， 需 施 加 中 等 以 上 压 力 才 能 挤 出 ； 3 = 即 使 施 加 较 大 压 力 也 无 法 挤 出 分 泌 物 [24, 25]。 评 估 DE 的 临 床 严 重 程 度 。 通 过 比 较 不 同 MMP-9 免 疫 测 定 指 标 类 别 （ 定 性 指 标 ： MMP-9 阳 性 与 阴 性 ； 定 量 指 标 ： MMP-9 阴 性 与 弱 阳 性 与 中 度 阳 性 与 强 阳 性 ） 的 DE 体 征 和 症 状 来 评 估 DE 的 临 床 严 重 程 度 。 如 果 患 者 组 表 现 出 更 严 重 的 DE 体 征 和 症 状 ， 则 认 为 该 指 标 类 别 相 对 更 严 重 。 统 计 方 法 。 数 据 以 均 值 ± 标 准 差 （ SD） 表 示 ， 除 非 另 有 说 明 。 使 用 SPSS 12.0 版 （ IBM 公 司 ， 美 国 伊 利 诺 伊 州 芝 加 哥 ） 进 行 统 计 分 析 。 采 用 独 立 样 本 t 检 验 比 较 两 组 间 年 龄 、 眼 表 疾 病 指 数 （ OSDI） 评 分 、 视 觉 模 拟 评 分 （ VAS） 、 泪 膜 破 裂 时 间 （ tBUT） 、 角 膜 染 色 、 结 膜 染 色 、 混 浊 度 和 睑 板 腺 分 泌 物 排 出 情 况 的 差 异 。 采 用 卡 方 检 验 分 析 与 干 眼 症 （ DE） 和 基 质 金 属 蛋 白 酶 -9（ MMP-9） 阳 性 相 关 的 各 种 全 身 性 疾 病 的 关 系 。 采 用 斯 皮 尔 曼 相 关 性 检 验 分 析 半 定 量 MMP-9 结 果 与 年 龄 、 OSDI 评 分 、 VAS 评 分 、 泪 膜 破 裂 时 间 、 角 膜 染 色 评 分 、 结 膜 染 色 评 分 和 睑 板 腺 功 能 障 碍 （ MGD） 评 分 之 间 的 关 系 。 采 用 皮 尔 逊 相 关 性 检 验 分 析 定 量 MMP-9 结果 与其 他 年 龄 、 OSDI 评 分 、 VAS 评 分 、 泪 膜 破 裂 时 间 （ tBUT） 、 角 膜 染 色 评 分 、 结 膜 染 色 评 分 和 睑 板 腺 功 能 障 碍 （ MGD） 评 分 。 双 侧 p 值 <0.05 被 认 为 具 有 统 计 学 意义 。

结 果

基 质 金 属 蛋 白 酶 -9（ MMP-9） 免 疫 测 定 的 定 性 结 果

研 究 人 群 的 人 口 统 计 学 特 征 。 本 研 究 共 纳 入 320 名 患 者 （ 320 只 眼 ） 。 平 均 年 龄 为 58 ± 13 岁 （ 范 围 14 - 90 岁 ） ， 其 中 男 性 97 人 （ 30%） 。 根 据 MMP-9 阳 性 情 况 划 分 的 患 者 人 口 统 计 学 数 据 见 表 1。 各 组 间 无 显 著 差 异 ， 系 统 性 自 身 免 疫 性 疾 病 （ 类 风 湿 关 节 炎 、 硬 皮 病 、 系 统 性 红 斑 狼 疮 、 重 叠 综 合 征 或 继 发 性 干 燥 综 合 征 ） 和 干 燥 综 合 征 的 存 在 情 况 也 无 显 著 差 异 （ p＞ 0.05） 。

MMP-9 免 疫 测 定 的 定 性 结 果 与 干 眼 症 状 之 间 的 比 较 。 MMP-9 阳 性 组 和 MMP- 9 阴 性 组 在 眼 表 疾 病 指 数 （ OSDI） 和 视 觉 模 拟 评 分 （ VAS） 方 面 无 统 计 学 显 著 差 异 （ p > 0.05； 表 2） 。

通 过 泪 膜 曲 率 测 量 法 测 量 泪 液 量 。 通 过 泪 膜 曲 率 测 量 法 测 得 的 平 均 泪 液 量 在 MMP-9 阳 性 组 和 MMP-9 阴 性 组 之 间 无 统 计 学 显 著 差 异 （ p > 0.05； 表 2） 。

泪 膜 破 裂 时 间 。 MMP-9 阳 性 组 的 平 均 泪 膜 破 裂 时 间 短 于 MMP-9 阴 性 组 ， 差 异 具 有 统 计 学 意 义 （ p = 0.020） 。 此 外 ， 当 按 泪 膜 破 裂 时 间 <3 秒 进 行 分 层 时 ， MMP-9 阳 性 组 泪 膜 破 裂 时 间 <3 秒 的 患 者 显 著 多 于 MMP-9 阴 性 组 （ p = 0.047； 表 2） 。

角 膜 和 结 膜 染 色 评 分 。 MMP-9 阳 性 组 的 平 均 角 膜 染 色 评 分 更 高 ， 差 异 具 有 统 计 学 意 义 （ p = 0.012） 。 当 以 角 膜 染 色 评 分 大 于 2 为 分 界 点 进 行 分 层 分 析 时 ， MMP-9 阳 性 组 的 患 者 数 量 显 著 多 于 MMP-9 阴 性 组 （ p = 0.018； 表 2） 。 此 外 ， MMP-9 阳 性 组 和 MMP-9 阴 性 组 的 平 均 结 膜 染 色 评 分 无 显 著 差 异 （ p > 0.05） 。 当以 结 膜 染 色 评 分 进 行 分 层 时

染 色 评 分 ＞ 2 分 的 患 者 在 MMP-9 阳 性 组 中 明 显 多 于 MMP-9 阴 性 组 （ p = 0.008； 表 2） 。 在 MMP-9 阴 性 组 中 ， 睑 板 腺 平 均 混 浊 度 略 高 于 MMP-9 阳 性 组 ， 但 差 异 无 统 计 学 意 义 （ p＞ 0.05） 。 两 组 睑 板 腺 表 达 分 级 无 显 著 差 异 （ p＞ 0.05） 。 MMP-9 阳 性 组 中 睑 板 腺 功 能 障 碍 （ MGD） 分 级 ＞ 3 的 比例 较 高 ， 但 差 异 无 统 计 学 意 义 （ p＞ 0.05； 表 2） 。

MMP-9 免 疫 测 定 的 半 定 量 和 定 量 结 果

研 究 人 群 的 人 口 统 计 学 特 征 。 各 组 分 配 患 者 的 基 线 人 口 统 计 学 特 征 见 表 3。 四 组 在 年 龄 、 性 别 、 系 统 性 自 身 免 疫 性 疾 病 、 干 燥 综 合 征 以 及 系 统 性 疾 病 （ 糖 尿 病 、 高 血 压 、 甲 状 腺 疾 病 、 心 脏 疾 病 、 睡 眠 障 碍 、 帕 金 森 病 、 其 他 神 经 系 统 疾 病 和 肺 部 疾 病 ） 方 面 均 无 差 异 （ p＞ 0.05） 。

MMP-9 免 疫 测 定 的 半 定 量 结 果 与 DE 严 重 程 度 的 比 较 。 四 组 在 年 龄 、 OSDI、 VAS、 Schirmer 评 分 、 tBUT、 tBUT≤ 3 秒 、 角 膜 染 色 评 分 、 结 膜 染 色 评 分 、 结 膜 染 色 评 分 ≥ 2、 睑 板 腺 混 浊 、 表 达 及 功 能 障 碍 方 面 均 无 显 著 差 异 （ p＞ 0.05） 。 然 而 ， 角 膜 染 色 评 分 ≥ 2 有 显 著 差 异 （ p = 0.036； 表 4） 。

与 半 定 量 MMP-9 免 疫 测 定 结 果 具 有 临 床 意 义 的 相 关 性 。 泪 膜 破 裂 时 间 （ tBUT） 与 半 定 量 MMP-9 免 疫 测 定 结 果 呈 显 著 负 相 关 （ ρ = -0.125， p = 0.025； 表 5） 。 相 反 ， 角 膜 染 色 评 分 与 半 定 量 MMP-9 免 疫 测 定 结 果 呈 显 著 正 相 关 （ ρ = 0.122， p = 0.029； 表 5） 。 其 他 参 数 ， 如 年 龄 、 眼 表 疾 病 指 数 （ OSDI） 评 分 、 视 觉 模 拟 量 表 （ VAS） 评 分 、 施 墨 试 验 （ Schirmer） 评 分 、 睑 板 腺 功 能 障 碍 （ MGD） 和 结 膜 染 色 评 分 ， 均 未 显 示 出 显 著 相 关 性 （ p > 0.05； 表 5） 。

与 定 量 MMP-9 免 疫 测 定 结 果 具 有 临 床 显 著 关 联 的 因 素 。 年 龄 、 眼 表 疾 病 指 数 （ OSDI） 、 视 觉 模 拟评 分 （ VAS） 、 施 墨 试 验 值 、 泪 膜 破 裂 时 间 （ tBUT） 、 角 膜 染 色 评 分 、 结 膜 染 色 评 分 ，并 且 MGD 与 定 量 MMP-9 免 疫 测 定 结 果 在 临 床 上 无 显 著 相 关 性 （ p > 0.05； 表 6） 。

讨 论

干 眼 症 （ DE） 是 一 种 慢 性 疾 病 ， 影 响 50 岁 及 以 上 人 群 的 5%至 30%[1]。 传 统 上 ， 干 眼 症 的 症 状 通 过 干 眼 症 问 卷 进 行 评 估 ， 其 体 征 则 通 过 泪 膜 破 裂 时 间 （ tBUT） 、 角 膜 染 色 评 分 、 结 膜 染 色 评 分 、 泪 膜 评 估 以 及 施 墨 试 验 进 行 检 测 [1, 26]。 然 而 ， 干 眼 症 的 发 病 机 制 尚 未 完 全 明 了 。 在 过 去 20 年 里 ， 临 床 医 生 越 来 越 关 注 炎 症 ， 并 认 识 到 其 在 干 眼 症 体 征 和 症 状 的 发 展 及 加 重 中 起 着 关 键 作 用 [27]。 基 质 金 属 蛋 白 酶 -9 （ MMP-9） 是 一 种 非 特 异 性 炎 症 标 志 物 ， 干 眼 症 患 者 的 泪 液 中 MMP-9 水 平 升 高 [14, 17]。 Aragona 等 人 [28]证 明 ， 通 过 聚 合 酶 链 反 应 测 定 的 MMP-9 水 平 在 干 眼 症 患者 中 升 高 。

反应 与角膜或结膜染色评分以及泪膜破裂时间 （ tBUT）密切相关 。采用 酶联免疫吸附 测定法对基质金属蛋白酶 -9（ MMP-9）进行定量分析的方法已被引入；然而，该方法 耗时且成本高昂，难以在临床常规应用。

[29]. 为 了 克 服 这 些 缺 陷 ， 开 发 出 了 MMP-9 免 疫 测 定 法 （ InflammaDry） 。 这 种 免 疫 测定 法 具 有 成 本 低 、 出 结 果 快 以 及 设 备 制 备 简 便 等 优 点 。

[30]。

尽管 InflammaDry 是一种用于区分干眼症 （ DE）与非干眼症的即时免疫测定法 ， 但临床医生不可避免地对弱阳性结果和强阳性结果的临床意义产生了好奇。此外 ， InflammaDry 的基本原理是通过比色反应来显示条带，因此条带的清晰度有可能与 MMP-9 的浓度成比例变化，即与临床眼表炎症的程度成比例变化 。

在 本 研 究 中 ， 我 们 通 过 定 性 、 半 定 量 和 定 量 分 析 免 疫 印 迹 条 带 ， 评 估 了 泪 液 中 MMP-9 免 疫 测 定 的 结 果 。 在 定 性 分 析 中 ， 泪 膜 破 裂 时 间 （ tBUT） 较 短 、 tBUT 不 足 3 秒 、 角 膜 染 色 评 分 较 高 、 角 膜 染 色 评 分 达 2 分 及 以 上 以 及 结 膜 染 色 评 分 达 2 分 及 以 上 均 与 MMP-9 免 疫 测 定 结 果 呈 阳 性 相 关 。 这 表 明 MMP-9 免 疫 测 定 结 果 呈 阳 性 与 干 眼症 临 床 症 状 的 严 重 程 度 相 关 。 干 眼 症 中 泪 膜 的 不 稳 定 会 导 致 泪 液 高 渗 ，这随后会在角膜上皮诱导炎症反应。这些眼表的炎症级联反应会导致炎症细胞因子 的释放。因此 ， MMP-9 免疫测定的阳性结果可能与干眼症临床症状的严重程度有 关 [31, 32]。 Covita 等人 [33]报告称，更严重的睑板腺功能障碍与较短的泪膜破裂 时间 （ tBUT）相关。然而， 在本研究中 ， MMP-9 阳性和阴性组之间的睑板腺功 能障碍没有差异。 这些差异可能是因为在我们的研究中睑板腺功能障碍是由临床 医生主观评估的，而不是通过近红外照明成像评估的。在半定量分析中，我们发 现较短的 tBUT 和较高的角膜染色评分（在定性分析中已显示出显著差异）与半 定量 MMP-9 免疫测定结果相关。 Shimazaki-Den 等人 [34]表明黏蛋白成分与 tBUT 之间存在密切关系。由于黏蛋白在维持角膜健康方面起着重要作用，并由杯状细 胞分泌，而在诸如过敏等慢性炎症中，杯状细胞密度会降低 [35]。同样，干眼症 （ DE）中严重的角膜表面炎症会减少黏蛋白分泌，导致泪膜破裂时间 （ tBUT） 缩短或角膜染色评分升高。因此，使用基质金属蛋白酶 -9（ MMP-9）免疫测定法 观察到了一个高反应性条带。这一发现也在一定程度上与 Park 等人 [19]的研究结 果一致，他们证明了半定量 MMP-9 分级与干眼症的体征和症状之间存在良好的 相关性。然而，在我们的研究结果中，我们未能发现临床症状与 MMP-9 阳性之 间存在任何相关性。这是因为干眼症的症状是非特异性的，因为类似的症状也可 能出现在各种角膜表面疾病中，而且 Pflugfelder 等人 [36]报告称，只有 57%有症 状的患者表现出干眼症的临床体征。

有趣的是，使用 ImageJ 进行的定量分析（被认为是最准确的评估泪液中 MMP-9 水平的方法）显示， 免疫测定条带密度与干眼症的临床体征和症状之间没 有相关性。这一发现与上述提到的半定量分析结果截然相反，因为 MMP-9 免疫 测定的半定量分析与干眼症的临床严重程度有关。半定量和定量结果之间存在差 异的原因可能是，半定量结果仅基于试剂条带密度的解读，而定量结果则同时基 于试剂和对照条带密度。 在 MMP-9 免疫测定的半定量和定量分析中，相同的试 剂条带密度可能会有不同的解读。我们之前的研究表明 ， MMP-9 免疫测定试剂的 条带密度受泪液量的影响，因此不能准确反映泪液中 MMP-9 的浓度 [15, 20]。然 而，之前对该免疫测定的验证是在实验条件下进行的，且未考虑对照条带密度 。 因此，本研究中用于评估个体泪液量的定量分析可能更能表明定量检测结果与干 眼症临床体征之间的相关性，未来的研究可以采用这种方法。从这些结果来看 ， MMP-9 免疫测定呈阳性的患者往往表现出更严重的干眼症眼部体征；然而，对于 通过试剂条带密度的定量测量来评估干眼症临床严重程度的解读，还需要进一步 的研究，并且要考虑到个体的泪液量。

必 须 考 虑 以 下 限 制 ： 首 先 ， 必 须 考 虑 选 择 偏 倚 的 可 能 性 ， 因 为 该 研 究 是 在 一 家 三 级 医 院 进 行 的 。 在 基 层 医 院 或 二 级 医 院 中 ， 蒸 发 过 强 型 干 眼 症 控 制 不 佳 的 患 者 可 能 会 转 诊 至 我 们 医 院 ， 从 而 被 纳 入 本 研 究 。 本 研 究 未 对 干 眼 症 的 亚 型 进 行 评 估 。 因 此 ， 需 要 进 一 步 研 究 泪 液 中 MMP-9 阳 性 在 水 液 缺 乏 型 干 眼 症 和 蒸 发 过 强 型 干 眼 症 中 的 情 况 。 其 次 ， 本 研 究 未 评 估 泪 液 中 的 MMP-9 水 平 。 最 近 的 一 项 研 究 报 道 ， 随 着 MMP-9 浓 度 的 增 加 ， 条 带 密 度 会 增 加 [37]。 然 而 ， 测 量 泪 液 中 的 MMP-9 水 平 ， 并 对 MMP-9 免 疫 测 定 的 半 定 量 和 定 量 结 果 进 行 分 析 ， 可 能 会 提 供 更 准 确 的 信 息 。 最 后 ， 需 要 对 干 眼 症 的 临 床 体 征 和 症 状 进 行 随 访 ， 并 结 合 连 续 的 MMP-9 免 疫 测 定 结 果 进 行 比 较。

本 研 究 未 进 行 相 关 检 测 。 Soifer 等 人 [38]报 告 称 ， MMP-9 阳 性 可 预 测 泪 液 分 泌 长 期 减 少 ， 将 MMP-9 浓 度 降 至 检 测 不 到 的 水 平 的 抗 炎 治 疗 在 这 种 情 况 下 可 能 有 益 。 对 MMP-9 免 疫 测 定 进 行 半 定 量 或 定 量 分 析 的 长 期 随 访 研 究 ， 以 评 估 抗 炎 治 疗 的 效 果 ， 将 有 助 于 为 干 眼 症 患 者 制 定 治 疗 指 南 。 总 之 ， MMP-9 免 疫 测 定 的 阳 性 结 果 与 DE 眼 部 体 征 的 严 重 程 度 有 关 。 然 而 ， 利 用 MMP-9 免 疫 测 定 的 定 量 指 标 来 评 估DE 的 临 床 严 重 程 度 ， 尚 需 进 一 步 研 究 。

补 充 信 息 S1 数 据 集 。 （ XLSX） 图 S1. 图 形 结 果 。 泪 液 基 质 金 属 蛋 白 酶 9 免 疫 测 定 与 干 眼 症 体 征 和 症 状 的 相 关 性 。 （ TIF） 作 者 贡 献 概 念 化 ： 郑 钟 和 （ Jun Jong Hwa） 数 据 整 理 ： 李 贤 （ You Hyun Lee） 、 沈 奎 英 （ Kyu-Young Shim） 、 孙 明 镇 （ Myung-Jin Son） 、 金 哈 林 （ Harim Kim） 。 形 式 分 析 ： 李 贤 （ You Hyun Lee） 、 方 承 弼 （ Seung-Pil Bang） 、 沈 奎 英 （ Kyu-Young Shim） 。 调 查 ： 李 贤 （ You Hyun Lee） 、 方 承 弼 （ Seung-Pil Bang） 、 沈 奎 英 （ Kyu-Young Shim） 。 方 法 论 ： 全 钟 和 （ Jong Hwa Jun） 。 项 目 管 理 ： 李 贤 （ You Hyun Lee） 、 全 和 （ Jong Hwa Jun） 资 源 ： 李 贤 （ You Hyun Lee） 、 全 和 （ Jong Hwa Jun） 指 导 ： 郑 钟 和 （ 音 译 ） 验 证 ： 李 贤 利 ， 全 和 俊 。 写 作 - 初 稿 ： 李 贤 （ You Hyun） 李 ， 全 和 （ Jong Hwa） 君 。 写 作 - 审 校 与 编 辑 ： 李 贤 （ You Hyun Lee） 、 全 和 （ Jong Hwa Jun）

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