在泪液功能障碍综合征中，眼表基质金属蛋白酶-9的生成及活性增加

目的：评估泪液分泌功能障碍（DTS）患者眼表金属蛋白酶 （MMP）-9 的生成及活性，并确定 MMP-9 活性与临床参数 之间的任何相关性。 方法：招募了 46 名新诊断为干眼症（DTS）的患者和 18 名 对照受试者。对所有受试者进行了全面的眼表检查。通过 MMP-9 活性测定法对 1 微升未刺激的泪液中的泪液 MMP-9 活性进行了评估。使用 19 名干眼症患者和 16 名对照者的结 膜上皮细胞，通过半定量实时 PCR 评估了 MMP-9 及其调节 细胞因子的 mRNA 转录水平。 结果：四个基于 DTS 严重程度分组的每组平均 MMP-9 活性 均显著高于对照组（8.39 ± 4.70 ng/mL）。DTS4 组的 MMP9活性最高（381.24 ± 142.83 ng/mL），其平均值显著高于 其他 DTS 组。此外，DTS 患者的结膜上皮中 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 TGF-β1 的 mRNA 转录水平显著高于对照组。泪液 中 MMP-9 活性与症状严重程度评分、低对比度视力下降、 荧光素泪膜破裂时间、角膜和结膜荧光素染色、地形图表面 规则性指数（SRI）以及共聚焦显微镜下角膜上皮异常区域百 分比均呈显著相关。 结论：干眼症（DTS）患者的泪液中基质金属蛋白酶-9（MMP-9）活性显著升高。这种活性与 MMP-9 及其调节基 因的 mRNA 表达增加有关，并且与临床参数密切相关。MMP-9 似乎是一种潜在有用的生物标志物，可用于诊断、分 类以及评估干眼症。

监测 DTS。（《投资眼科与视觉科学》2009 年；50 卷：3203 - 3209 页）DOI:10.1167/iovs.08-24762006 年德尔菲干眼症小组报告提出了“泪液功能障碍综合 征（DTS）”这一更全面的术语来描述干眼症。目前认为，DTS 中泪液成分的变化可能会破坏泪膜的稳定性，并导致眼 表上皮损伤。1 矩阵金属蛋白酶（MMPs）是由眼表和腺体上 皮细胞在受到刺激时以及浸润这些组织的炎症/免疫细胞产生 的蛋白水解酶。MMPs 活性增强被认为与这些眼表病理变化 有关。5,7基质金属蛋白酶（MMPs）在伤口愈合和炎症过程中发 挥着至关重要的作用。8,9 干燥性角膜结膜炎（KCS）患者的 泪液中检测到 MMP-3 和 -9 的水平升高。10,11 在基质金属蛋白 酶中，MMP-9 被发现对于分解维持角膜上皮屏障的上皮基底 膜成分和紧密连接蛋白（如 ZO-1 和闭合蛋白）具有核心作用。function.12–14 MMP-9 属于明胶酶类金属蛋白酶，可降解变性 胶原蛋白；天然的 IV、V 和 VII 型胶原蛋白；以及弹性蛋白。 正常健康眼睛的角膜上皮细胞中 MMP-9 的表达水平较低。15 在患有无菌性角膜溃疡的个体的眼睛中，发现角膜上皮细胞 中 MMP-9 的生成增加。16 在实验性干眼症小鼠模型中，MMP-9 活性的增加与角膜上皮屏障功能的破坏和角膜表面的 不规则性有关。17 与野生型小鼠相比，MMP-9 基因敲除小鼠 在实验性干燥应激下角膜上皮屏障功能的改变显著减少。17 但通过局部向眼表应用 MMP-9，这种保护作用被消除。17先前的人体研究发现，通过酶联免疫吸附测定（ELISA） 检测，酒渣鼻患者泪液中前 MMP-9 的浓度升高。5,10所罗门等 人4发现睑板腺疾病和斯若综合征患者的泪液中 MMP-9 的活 性升高。 目的：检测正常眼及不同干眼症（DTS）组患者泪液中 基质金属蛋白酶-9（MMP-9）活性，分析泪液中 MMP-9 活 性与 DTS 临床参数的相关性，并测定结膜上皮中 MMP-9 及 其调节细胞因子的 mRNA 转录水平。大多数基质金属蛋白酶 （MMPs）以无活性的酶原（proMMPs）形式分泌，需要在 细胞外激活后才能裂解细胞外基质成分。本研究旨在测量正 常眼及经德尔菲专家小组和干眼症研讨会（DEWS）分类的 不同 DTS 组患者泪液中总活性 MMP-9 的水平。

方法

该临床方案已获得贝勒医学院机构审查委员会的批准，并符合 《赫尔辛基宣言》的原则。在提供知情同意后，由单一研究者 （SCP）新诊断出的 46 名 DTS 患者和 18 名无症状对照受试者被 招募，以测量泪液中 MMP-9 的活性。另外，还招募了 19 名新诊 断出的 DTS 患者和 16 名无症状对照受试者，以评估结膜上皮中 的基因表达。对所有研究参与者依次进行了以下眼表和泪液检查： 完成眼表疾病指数（OSDI）症状问卷、18,19采集未刺激的泪液样本、 荧光素泪膜破裂时间（TBUT）、角膜和结膜荧光素染色以及 Schirmer I 试验。最后，进行了印迹细胞学检查以获取细胞，用于 评估基因表达。

诊断干眼症（DTS）的标准包括：眼表疾病指数（OSDI）评 分 ⬎20 1,18-20，同时伴有以下一种或多种体征：泪膜破裂时间 （TBUT） ⱕ7 秒、19,21角膜荧光素染色点状、或 Schirmer I 试验 值 ⬍10 毫米。如果受试者正在使用任何局部药物或患有其他眼表 疾病，则予以排除。

根据 DEWS 22 报告中所列标准，患者被分为四个严重程度级 别，如表 1 所示。睑缘疾病和泪液异常体征可在任何严重程度级 别中出现。若未完全符合某一严重程度组的所有标准，则依据最 差参数进行严重程度分级。无症状对照受试者从贝勒医学院进行 常规眼部检查的员工中招募。

参与者完成了包含 12 个项目的 OSDI 问卷，这些项目用于测 量视觉功能、眼部刺激症状以及压力环境条件的影响。18 该问卷 的得分范围从 12 分（无症状）到最高 64 分。

高对比度和 10% 低对比度视力的测量

使用标准的 EDTRS 视力表测量高（100%）和低（10%）对比度的 最佳矫正视力，该视力表安装在距离受试者眼镜平面 4 米的支架 上。视力表的背景亮度设定为 85 坎德拉/平方米2，环境亮度调整 为 3 cd/m2.23,24 记录高对比度和低对比度视力之间的差异。

电脑角膜地形图检查法

使用 TMS-2 角膜地形图系统（Tomey 公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆） 进行角膜地形图检查，具体操作如先前报道所述。20 由仪器软件 计算得出的 SRI 值被记录下来。

泪液收集

从每只眼睛的下泪河无创地用毛细作用力收集 0.5 微升的泪液，所 用工具为 0.5 微升的玻璃毛细管（Drummond Scientific 公司，宾夕 法尼亚州布鲁姆艾尔）。双眼的泪液样本（总计 1 微升）被洗脱 到一个装有 9 微升磷酸盐缓冲液和 0.1%牛血清白蛋白（BSA；Sigma-Aldrich 公司，密苏里州圣路易斯）的无菌管中。 这些试管用带有橡胶 O 型圈的盖子密封以防止蒸发，并立即储存 在 -80°C 的环境中，直至进行活性测定。荧光素泪膜破裂时间

在用不含防腐剂的生理盐水（Unisol；爱尔康公司，得克萨斯州沃 思堡）浸湿的荧光素钠试纸（Fluor-I-Strip；博士伦制药公司，佛 罗里达州坦帕）触碰下睑结膜后，如先前报道的那样，在蓝光照 明下检查角膜前泪膜。20

结膜和角膜荧光素染色

如前所述，在向泪膜滴入荧光素 2 分钟后对眼表进行了检查。鼻 侧结膜和颞侧结膜的荧光素染色强度采用改良的范·比斯特维尔德 分级方案进行记录，分级范围为 0（无）至 3（融合）。25 而角膜 荧光素染色的强度则采用贝勒分级方案在角膜的五个不同区域 （中央、上方、颞侧、下方和鼻侧）进行评估，根据染色点的数 量按 5 分制分级：无点，0 分；1 至 5 个点，1 分；6 至 15 个点，2 分；16 至 30 个点，3 分；＞30 个点，4 分。若存在一处融合区 域加 1 分；两处或更多融合区域加 2 分；丝状角膜炎加 2 分。 26

施墨试验 I 型

通过将 Schirmer 试纸（爱尔康公司生产）置于下眼睑边缘外侧三 分之一与中间三分之一交界处，进行 5 分钟的 Schirmer I 试验。 记录试纸湿润的长度（单位：毫米）。

共聚焦显微镜技术

对 7 名 DTS 患者和 3 名正常对照者的角膜进行了共聚焦显微镜检 查（使用 Retina Tomograph II 结合 Rostock 角膜模块；德国海德堡 工程公司，海德堡，德国）。在局部麻醉后，将一滴光学耦合介 质凝胶（GenTeal，0.3% 羟丙甲纤维素；瑞士诺华眼科公司，巴塞 尔，瑞士）滴入下穹窿结膜。从空气角膜上皮界面后方的上皮下 神经丛开始，依次拍摄图像。使用 NIHJ 软件（由美国国立卫生研 究院的 Wayne Rasband 开发，网址为 http://rsb.info.nih.gov/ij/index. html），由两名盲法观察者在数字图像中测量异常上皮区域，该区 域由单个或多个高反射不透明细胞或细胞核固缩或呈蛇形的细胞 定义。异常区域的面积计算为中央角膜四个随机选取区域的平均 百分比，每个区域的大小为 400×400 微米。结膜上皮细胞的采集通过印迹细胞学技术获取结膜上皮细胞。双眼各滴入一滴麻醉剂， 然后多余的液体用纸巾吸干。将无菌硝酸纤维素滤纸（0.45 微米 HA，直 径 45 毫米，货号 HAWP04700；密理博，马萨诸塞州贝德福德）裁 成 5×8×6×10 毫米的锥形矩形，贴在每只眼的颞侧和下穹窿结膜上。 用镊子轻轻将滤纸从结膜表面揭下，放入装有 RNA 裂解液的管中。

泪液中基质金属蛋白酶-9（MMP-9）活性

采用 MMP 活性检测试剂盒（Biotrak；Amersham Biosciences，新泽 西州皮斯卡塔韦）按照制造商的方案测定总 MMP-9 酶活性。简而言 之，将 100 微升的每种前 MMP 标准品（0.125 - 4 纳克/毫升）、稀释 的泪液（1 微升泪液加 9 微升 PBS 和 0.1% BSA 稀释于 90 微升检测 缓冲液）以及检测缓冲液（用于空白对照）在预包被有抗 MMP-9 鼠 单克隆捕获抗体的微量滴定板孔中于 4°C 下孵育过夜。用含 0.05% 吐温 - 20 的 0.01 摩尔/升磷酸钠缓冲液（pH 7.0）洗涤板四次。通过 在 37°C 下用 50 微升 1 毫摩尔/升对氨基苯甲酰汞乙酸盐（APMA） 在检测缓冲液中激活结合的前 MMP-9 1.5 小时来测定总 MMP-9 活性。 向每个孔中加入 50 微升检测试剂，样品在 37°C 下孵育 6 小时。通 过其激活经修饰的检测酶的能力来检测活性 MMP-9，该酶随后裂解 其显色肽底物。在酶标仪（Versamax；Molecular Devices，加利福尼 亚州森尼韦尔）上于 405 纳米处读取吸光度。通过标准曲线内插法确 定样品中 MMP-9 的活性。泪液样本的吸光度读数乘以 100 的稀释因 子。

RNA 提取与实时荧光定量 PCR

对 19 名干眼症患者和 16 名正常受试者的结膜上皮基因表达进行了评 估。从印迹细胞学样本中，使用含异硫氰酸胍的裂解液提取富含信使 核糖核酸（mRNA）的结膜上皮 RNA，然后通过选择性结合到硅胶 基膜上（RNeasy Micro 试剂盒；Qiagen 公司，马里兰州盖瑟斯堡） 进行纯化。通过在 260 纳米处的吸光度测量 RNA 浓度，样本在 -80°C 下保存，直至用于聚合酶链反应（PCR）。从 0.2 微克总 RNA 中， 使用随机六聚体通过 M-MuLV 逆转录酶（Ready-To-Go You-Prime First-Strand Beads；GE Health Care 公司，伊利诺伊州阿灵顿高地） 合 成 第 一 链 cDNA。 使 用 特 定 探 针 （TaqMan MGB；Applied Biosystems 公司，加利福尼亚州福斯特城）（检测编号分别为：Hs 99999905_m1、Hs 00234579_m1、Hs 00233962_m1、Hs 00174097_ m1、Hs 00174131_m1、Hs 00174128_m1 和 Hs 99999918_m1） 对 GAPDH、MMP-9、MMP-3、IL-1β、IL-6、TNF-α 和 TGF-β1 进行实 时 PCR 检测，PCR 主反应混合液（TaqMan Gene Expression Master Mix；ABI），在商用热循环系统（Mx3005P QPCR 系统；）中进行。 使用 Stratagene 公司（加利福尼亚州拉霍亚）的试剂盒，按照制造商 的建议进行操作。每次实验均进行双份测定。定量 PCR 的结果通过 比较 CT 法进行分析。27其中目标变化为 2⁻ΔΔCt。循环阈值 (Ct) 是 根据主（荧光）信号确定的，即信号超过用户定义阈值的循环 数。结果通过 GAPDH 的值进行标准化，正常对照组的相对 mRNA 水平用作校准器。

统计分析

统计分析使用商业软件（Prism；GraphPad 公司，加利福尼亚州拉霍 亚和 Excel；微软公司，华盛顿州雷德蒙德）进行。数据以均值 ± 标准差表示。数据的正态性通过 Kolmogorov-Smirnov 检验（采用 Dallal 和 Wilkinson 近似法）进行检查。对于正态分布和非正态分布 的多组数据，分别采用单因素方差分析（ANOVA）和 Kruskal-Wallis 检验来检测统计学差异。组间泪液 MMP-9 活性水平的统计学比较采 用两样本 t 检验。炎症细胞因子 mRNA 转录水平的比较采用双侧非 配对 t 检验。泪液 MMP-9 活性与临床参数（包括症状严重程度评分、 低对比度视力下降、泪膜破裂时间（TBUT）和共聚焦显微镜下异常 角膜上皮面积百分比）之间的相关性通过对数回归确定。泪液 MMP9活性与 SRI 评分、角膜荧光素染色评分和结膜荧光素染色评分之间 的相关性通过多项式回归确定。通过斯皮尔曼相关性检验计算统计学 意义，该检验对数据的正态性不做任何假设。P < 0.05 被认为具有统 计学意义。

结果

学习小组的特点

纳入了 46 例平均年龄为 54.7 ± 14.7 岁（80% 为女性，20% 为男性）的干眼症患者和 18 例平均年龄为 41.7 ± 13.0 岁 （72% 为女性，28% 为男性）的对照者，以测量泪液中基质 金属蛋白酶 -9（MMP-9）的活性。

表 2 列出了对照组和不同严重程度干眼症（DTS）患者 的主要临床特征。表 3 则列出了各干眼症严重程度级别中发 现的相关眼表疾病。

临床参数

患有干眼症的患者其 10%低对比度视力的平均下降值（0. 24 ± 0.06 logMAR）显著大于对照组（0.17 ± 0.04 logMAR） （P = 0.001）。低对比度视力的下降与干眼症状指数（OSDI） 问卷中关于模糊症状的两个问题的回答呈显著正相关（r2 = 0. 39，P < 0.001），但高对比度视力则未发现这种相关性（r2 = 0.07，P = 0.16）。

在通过共聚焦显微镜评估的受试者子集中，患有 DTS（DTS2 [n = 3]、DTS3 [n = 3] 和 DTS4 [n = 1]）的受试者中， 异常的角膜上皮细胞所占的百分比面积为 17.35% ± 15.41%， 而对照组受试者（n = 3）为 0.34% ± 0.38%（P < 0.03）。部 分患有 DTS 的眼睛存在异常。

角膜上皮细胞呈多边形，胞质高反光，细胞核呈暗红色 （固缩），核周有深色空隙。共聚焦显微镜的代表性图像 见图 1。

泪液中基质金属蛋白酶-9（MMP-9）活性

表 4 列出了所有干眼症（DTS）患者组的泪液基质金属蛋白 酶 9（MMP-9）活性。正常组和 DTS 组中，男性和女性参 与者的泪液 MMP-9 活性无显著差异。尽管 DTS 患者的平 均年龄高于正常对照组（54.7 岁对 41.7 岁，P = 0.01），但 在 20 至 80 岁的每个年龄段，正常组和 DTS 组的泪液 MMP-9 活性均无显著差异。

基质金属蛋白酶 -9（MMP-9）及其 调节细胞因子基因的表达

通过印迹细胞学从 19 名 DTS 患者（分别来自 DTS1 期 （n = 3）、DTS2 期（n = 2）、DTS3 期（n = 4）和 DTS4 期（n = 10））和 16 名正常受试者获取的结膜上皮中，采 用实时 PCR 技术检测编码 MMP-9 及其调节炎症细胞因子 的 mRNA 转录水平，结果见图 2。DTS 患者的 MMP-9、IL1β、IL-6、TNF-α 和 TGF-β1 转录水平显著高于正常受试者 （P < 0.05）。正常受试者和 DTS 患者的样本中均未检测到 MMP-3 转录。

泪液中基质金属蛋白酶-9（MMP-9）活 性与临床参数的相关性

对泪液中 MMP-9 活性与所有临床参数之间的相关性进行了 评估（图 3）。泪液中 MMP 活性与症状严重程度评分、SRI 评分、角膜荧光素染色评分、结膜荧光素染色评分呈显 著正相关（P < 0.001），与低对比度视力下降呈显著正相关 （P = 0.002），与荧光素泪膜破裂时间呈显著负相关（P < 0.001）。在进行共聚焦显微镜检查的患者亚组中，其与共 聚焦图像中角膜上皮异常区域的百分比也呈显著正相关 （r2 = 0.64，调整后的 r2 = 0.57，P = 0.005）。

讨论

干眼症是一种常见的眼表疾病，会影响工作效率和生活质 量。德尔菲专家小组和干眼症工作组已提出了干眼症的诊 断标准和管理指南。本研究对不同严重程度干眼症患者群 体的泪液中基质金属蛋白酶 -9（MMP-9）活性进行了评估。 每个干眼症泪液分泌试验（DTS）组的平均泪液基质金 属蛋白酶-9（MMP-9）活性均显著高于正常受试者。此外， 最严重的 DTS 组（DTS4）的平均 MMP-9 活性最高，显著 高于其他 DTS 组。DTS1 组和 DTS2 组的平均 MMP-9 活性 无显著差异；然而，DTS3 组的平均 MMP-9 活性显著高于 DTS1 组。这些发现表明，即使在轻度干眼症中，泪液 MMP-9 活性也会显著升高，这可能比临床体征更具诊断意 义。这种升高似乎具有临床意义，泪液 MMP-9 活性可能比 传统的临床体征更能反映疾病的严重程度。 泪液中 MMP-9 的活性与干眼症常规诊断测试的结果 （症状严重程度评分、SRI 评分、荧光素泪膜破裂时间以 及角膜和结膜荧光素染色评分）显示出很强的相关性。这些临床发现表明

这无疑可归因于 MMP-9 能够降解上皮紧密连接和基底膜 蛋白，从而导致上皮通透性改变和上皮细胞黏附性差。17

在本研究中，我们还测量了 10%低对比度视力。尽管 可以通过 100%高对比度视力来评估 DTS 对视觉功能的影 响，但低对比度视力可能是衡量这种状况对视觉质量影响 的更实用且更敏感的指标。先前对正常受试者的研究发现， 中间视觉下的低对比度视 力与视网膜图像质量的相关性比中间视觉或光觉下的高对 比度视力更强。28,29 此外，该技术能够检测出高对比度测 试未能发现的圆锥角膜患者的视力下降。30 此外，一项先 前的研究发现，基于泽尼克的光学矫正对低对比度视力的 恢复影响更大。31 在我们的研究中，除了发现 10%低对比 度视力下降与泪液中 MMP-9 活性之间存在显著相关性外， 我们还发现低对比度视力下降与泪液中 MMP-9 活性的相 关性更强。

与 OSDI 问卷中关于症状模糊的两个问题的回答相比，100% 高对比度视力的关联程度要低得多。

由于共聚焦显微镜能够揭示细胞水平上的临床形态学 相关性，它正成为一种越来越有价值的临床工具。此前有 报道称，正常的浅层角膜上皮细胞具有暗色的细胞核和细 胞质，以及明亮的边界。32 以往对干眼症的共聚焦显微镜 研究发现，角膜神经和浅层角膜上皮细胞密度降低，但基 底细胞密度未变。33,34 在本研究中，发现泪液中 MMP-9 活 性与异常浅层角膜上皮细胞的百分比面积之间存在相关性。 这种浅层上皮细胞光学特性的变化可能预示着由干燥应激 和泪液蛋白酶活性增加所引起的上皮脱落的早期阶段。

在我们的研究中，通过半定量实时 PCR 技术在转录水 平上证实了眼表上皮细胞中 MMP-9 的刺激性生成以及刺激 MMP-9 生成的细胞因子（IL-1、IL-6、TNF-α 和 TGF-β1） 的生成。Aragona 等人（IOVS 2008；49：ARVO E-摘要 123）也观察到了类似的结果。干眼症相关的泪膜渗透压升 高被认为是一种促炎刺激。35 将培养的人角膜上皮细胞暴 露于渗透压逐渐升高的培养基中，已被发现会刺激 MMP-9 和多种炎症细胞因子（如 IL-1β 和 TNF-α）的生成（Li D 等人，IOVS 2002；43：ARVO E-摘要 1981；Luo L 等人，IOVS 2003；44：ARVO E-摘要 1026）。这些炎症细胞因子 反过来又被证明会刺激角膜上皮细胞生成多种 MMP，包括 MMP-9。36,37在它的多种活动中，MMP-9 能够将前体 IL-1β 和潜伏 的 TGF-β1 激活为活性形式。在几种蛋白酶中，MMP-9 被 发现是激活前体 IL-1β 最有效的蛋白酶。4,38 因此，眼表 MMP-9 活性的增加会加剧 DTS 中基于免疫的慢性炎症。 事实上，在先前的一项研究中已证实，MMP-9 可通过调节 愈合角膜中的炎症反应来促进角膜上皮再生。39 这些发现 表明，DTS 能够启动一个不断升级的细胞因子和蛋白酶循 环，这对眼表可能产生有害影响。 我们发现结膜上皮中 IL-6 基因表达显著增加，这与之 前报道的干燥综合征和非干燥综合征相关性泪液缺乏症的 研究结果一致。3,40,41 干眼症患者泪液中 IL-6 浓度显著升高， 且与上皮细胞中 IL-6 表达增加有关。42,43 应当指出的是， 另一项研究发现，在包括干眼症在内的多种眼表疾病中， 只有结膜松弛症患者的眼中 IL-6 水平升高。44 有趣的是， 该研究发现，与对照眼相比，所有眼表疾病患者的泪液中 MMP-9 浓度均升高。这一发现支持了泪液中 MMP-9 升高 是眼表上皮疾病的一个共同特征的观点，不论病因如何。15 这与我们在表 3 中所列的与 DTS 相关的各种情况中发现的 泪液中平均 MMP-9 活性增加以及泪液中 MMP-9 活性与角 膜和结膜上皮疾病严重程度的强相关性是一致的。

基质金属蛋白酶-9（MMP-9）以无活性的前酶形式分 泌，需要在细胞外激活才能发挥作用。在体外实验中，MMPs 可通过化学和物理因素激活，例如氨基苯基乙酸汞 （AMPA）、低 pH 值和高温。在体内，MMPs 通常由其他 蛋白酶激活。已有报道表明，MMP-9 可被纤溶酶激活，而 被 MMP-3 激活的效率更高。10,45,46 我们团队之前的一项研究发 现，通过实时 PCR 检测 1 微克 RNA，培养的人角膜上皮 细胞在经白细胞介素-17（IL-17）处理后，MMP-3 mRNA 转录水平升高。47

在本研究中，我们采用相同方法未能检 测到结膜上皮细胞中的 MMP-3 转录本；然而，通过印迹细 胞学法获得的总 RNA 量较少，这可能降低了检测的灵敏度。 实际上，在之前的一项研究中，通过实时 PCR 检测从视黄 酸处理的培养人结膜上皮细胞中提取的 2 微克 RNA，检测 到了 MMP-3 转录本。48 未能检测到 MMP-3 的其他可能解 释是：它由基质细胞或炎症细胞产生，而这些细胞在细胞 学样本中的密度较低，或者结膜上皮中 MMP-3 的生成量低 于角膜上皮。49 -52 对于泪液中 MMP-9 活性的测定，我们最 初试图在未使用 AMPA 处理的情况下测量泪液中活性 MMP-9 酶的水平；然而，发现其水平过低，无法进行统计 比较。

总之，我们发现所有干眼症泪液基质金属蛋白酶 9（MMP-9）活性的平均值均有所增加，这一结果在基因转 录水平上得到了证实。在 DTS3 和 DTS4 组中，泪液中 MMP-9 的平均活性显著高于其他干眼症组。MMP-9 活性 与临床参数也存在很强的相关性。这种微创且灵敏的 MMP9检测方法能够评估 MMP-9 的重要作用，并可能对干眼症 的诊断、分类和监测具有临床帮助。它可能成为未来干眼 症临床试验中的一个重要临床参数。

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