基质金属蛋白酶-9点式免疫测定法与泪液渗透压及眼表参数的相关性

背景：干眼症是一种多因素疾病，由于致病因素众多，诊断较为困难。本研究旨在评估干眼症患者泪膜基质金属蛋白酶-9（MMP9）、泪膜渗透压与眼表参数之间的相关性。方法：我们对确诊为干眼症的患者进行了回顾性病历审查，并研究了非侵入性泪膜破 裂时间（NIBUT）、角膜染色评分与MMP-9 分级、泪膜渗透压及 Schirmer 试验 I 结果之间是否存在关联。结果：本研究共纳入 24 名患者的 24 只眼。MMP-9 分级（0 - 4）与泪膜渗透压呈正相关（p < 0.027）。然而，MMP-9 的定性（阳性或阴性）及定量 （0 - 4 分级）测量值均未与任何其他眼表参数相关。角膜染色阳性组的渗透压显著高于阴性组（分别为 321.6 ± 19.261 和 299. 89 ± 16.213；p < 0.018）。其他眼表参数均未与泪膜渗透压相关。结论：泪膜基质金属蛋白酶 -9（MMP-9）可能是泪膜渗透压 的一个指标，反之亦然。此外，渗透压可能与干眼症患者的角膜染色存在关联。泪膜 MMP-9 和渗透压检测在临床实践中可作为 识别干眼症炎症的有用且便捷的评估工具。

1. 简介

干眼症是一种多因素疾病，由于致病因素众多，诊断较为困难[1, 2]。施墨试验 I、泪膜破裂时间、角膜和结膜染色评分、睑板腺评分以及症状问卷是评估干眼症的常用方法[3,4]。此外，还有两种市售的客观干眼检测方法，即泪膜基质金属蛋白酶-9（MMP-9）检测和泪膜渗透压检测，也可用于诊断干眼症。炎症在干眼症的发病机制中越来越被认为是关键因素。MMP-9 和渗透压在干眼症相关的炎症通路中起着重要作用[5-7]。因此，市售的 MMP-9 和渗透压检测已被引入临床，以辅助干眼症的诊断。基质金属蛋白酶-9（MMP-9）传统上在实验室通过酶联免疫吸附测定（ELISA）或蛋白质组学技术进行检测，但由于其操作不便，即耗时且需要非即时检测环境，因此在临床环境中并未得到广泛应用[8, 9]。然而，InflammaDry 是一种非侵入性、一次性使用的即时检测产品，其开发旨在InflammaDry 可在临床中便捷地同时检测出活性和潜伏性 MMP-9 [1, 4, 9]。 当 MMP-9 水 平 超 过 40 ng/mL 时 ，InflammaDry 显示为阳性结果 [1, 9, 10]。

过去，TearLab 渗透压系统是唯一一款可商用的能测量泪膜渗 透压的设备。TearLab 设备采用微电极，无创测量 50 纳升泪 液样本的电抗值[2, 11, 12]。不过，最近市场上又推出了一款 新型的 I-PEN 渗透压系统。 ® 使用。I-PEN 同样采用电阻抗法进行渗透压测量，但与 TearLab 系统®不 同的是，I-PEN 渗透压系统无需泪液转移 ® 样品可送至单独的测量单元，并且可以用较小的手持设备进 行操作[11]。 基质金属蛋白酶 -9（MMP-9）与渗透压之间的关系尚未 得到广泛评估，文献中也存在差异。李等人[13]和范德梅德等 人[6]报告称，MMP-9 与渗透压相关。然而，沙尔古斯等人[4]报告称，MMP-9 与渗透压之间没有相关性。因此，本研究旨 在评估干眼症患者中 InflammaDry MMP-9、手持式 I-PEN 泪 膜渗透压以及其他眼表参数（包括 Schirmer 试验 I、非侵入 性泪膜破裂时间（NIBUT）和角膜染色评分）之间的相关性。

2. 材料与方法

2.1. 研究设计：本研究回顾性分析了 2018 年 6 月 1 日至 2018 年 6 月 30 日期间干眼症患者的病历资料。本研究已获得 Bucheon 圣玛丽医院机构审查委员会的批准，并遵循了《赫 尔辛基宣言》的原则。

2.2. 参与者。本研究纳入了被诊断为干眼症的患者，干眼症的 定义为眼表疾病指数（OSDI）评分≥13，且符合以下一项或 多项指标：（1）泪膜破裂时间（NIBUT）<10 秒；（2）眼 表渗透压，任一眼>308 毫渗量/升或双眼差值>8 毫渗量/升； （3）根据泪膜与眼表学会（TFOS）干眼症研讨会（DEWS）II 的定义，角膜染色评分呈阳性[14]。研究纳入了年龄大于 18 岁的患者，且仅对右眼进行评估。排除标准包括：患有过 敏性结膜炎、葡萄膜炎、假性剥脱综合征、圆锥角膜或疱疹 性角膜炎；在研究前一个月内佩戴过隐形眼镜；在研究前三 个月内接受过眼部手术；使用过皮质类固醇、免疫抑制剂、 抗青光眼药物、环孢素或抗组胺药；或被诊断患有自身免疫 性疾病，包括干燥综合征、史蒂文斯 - 约翰逊综合征和移植 物抗宿主病。

2.3. 临床评估。我们检测了泪膜破裂时间（NIBUT）、角膜 染色评分、泪液渗透压、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）水平 以及施墨试验 I 的结果。 使用 I-PEN 渗透压系统（I-MED Pharma Inc. 公司，多拉德德 斯奥尔）对泪膜渗透压进行了检测。 ® （加拿大魁北克省奥尔莫）。首先，将 I-PEN 一次性传感器 插入设备中，然后要求患者闭眼 30 至60 秒。接下来，让患者睁开眼睛，将传感器尖端置于睑结膜 上，操作者确保传感器的两个金节点与睑结膜良好接触。定 位完成后，I-PEN 会发出声音提示，并在屏幕上显示渗透压 值[11]。

MMP-9 检测使用的是 InflammaDry 检测试剂盒（美国佛 罗里达州萨拉索塔市 Rapid Pathogen Screening 公司生产）。 简要步骤如下：将一块样本拭子轻轻多次按压在下眼睑结膜 的多个位置，使其充分浸透泪水。接着，将浸透泪水的样本 拭子轻轻放置在检测盒体的转移窗口上，并用力按压直至组 装妥当。将组装好的检测单元的吸水端浸入缓冲液中 20 秒， 然后将检测单元平放 10 分钟。10 分钟后，观察窗口以判断 MMP-9 的检测结果。蓝色线表示检测有效；因此，若未出现 蓝色线，则检测无效。红色线表示阳性结果，表明 MMP-9 浓 度≥40 ng/mL。然而，若出现蓝色线而无红色线，则表示阴 性结果，表明 MMP-9 浓度<40 ng/mL [1, 4, 9]。阳性红线根据 分级指标由经验丰富的调查员（ECK）主观分级，按不同强 度分为：微量阳性、弱阳性、阳性、强阳性[1]。

施墨试验 I 在未使用麻醉剂的情况下进行。简而言之， 将一条无菌试纸（Eagle Vision，美国孟菲斯）插入下眼睑外 侧三分之一处，让患者闭眼保持 5 分钟。5 分钟后，测量湿 润的长度。

使用德国韦茨拉尔的 Oculus 公司生产的 Oculus Keratogra ph 5 M 设备测量非侵入性泪膜破裂时间（NIBUT）。该设备 通过红外线实时检测泪膜局部破裂情况，无需使用荧光素试 纸。患者被指导眨眼两次以稳定泪膜。随后，患者被要求不 要眨眼，凝视中央光源。测量过程中，22 个环（每个环有超 过 1000 个测量点）投射到角膜上，每帧产生 22000 个分析数 据点。泪膜破裂点会出现在网格图上，视频记录在 25 秒后或 患者下一次眨眼时停止。从泪膜首次出现破裂到记录的时间 即为 NIBUT [15, 16]。

根据牛津分级标准[17]评估角膜染色评分。由一名研究者 （ECK）使用荧光素对角膜上皮点状染色和糜烂进行染色， 并参照参考图[17]从 0（无）到 5（严重）进行评分。

2.4. 统计分析。使用 SPSS 软件（版本 22.0，IBM 公司，纽约 州阿蒙克市，美国）进行统计分析。首先，采用柯尔莫哥洛 夫 - 斯米尔诺夫检验进行正态性分析，对于正态分布的数据， 两组间比较采用独立样本 t 检验，对于非正态分布的数据则 采用曼 - 惠特尼检验。

对于非正态分布的数据，接下来使用皮尔逊相关性检验 对正态分布数据进行相关性分析，使用斯皮尔曼等级相 关检验对非正态分布数据进行相关性分析。结果以均值± 标准差（SD）的形式呈现。所有分析中，p < 0.05 被认 为具有统计学意义。

3. 结果

本研究共纳入 24 名患者的 24 只眼。患者的基本特征见 表 1。参与者平均年龄为 48.33 ± 14.80 岁（其中女性 17 名，占 70.8%）。

3.1. MMP-9 与渗透压。在 24 只眼中，19 只眼（79%）MMP-9 检测呈阳性，5 只眼（21%）呈阴性（表 2）。MMP-9 阳性组的泪膜渗透压高于 MMP-9 阴性组（分别 为 315.95 ± 22.205 和 304.0 ± 11.269），但差异无统计 学意义（p = 0.302）（表 2）。

然而，在我们将患者按 MMP-9 分级（0 - 4 级）细分 后，观察到 MMP-9 分级与渗透压之间存在统计学上显著 的正相关（p < 0.027）（表 3 和图 1(a)）。

3.2. 基质金属蛋白酶 9（MMP-9）与眼表参数。当我们评 估 MMP-9 的定性结果（阳性或阴性）以及其他眼表参数 （包括泪液分泌试验、非侵入性泪膜破裂时间以及角膜 染色评分）时，MMP-9 阳性组与阴性组之间无统计学差 异（表 2）。此外，MMP-9 的分级（0 - 4）与其他任何 参数均无相关性（表 3）。

接下来，我们根据干眼症的严重程度将每个眼表参 数分为两组：角膜染色评分阳性组和阴性组；泪液分泌 试验 I 值<10 毫米组和≥10 毫米组；泪膜破裂时间<5 秒 组和≥5 秒组（表 4），并比较了各组间 MMP-9 等级的 差异。角膜染色评分阳性组和阴性组、泪液分泌试验 I 值<10 毫米组和≥10 毫米组、泪膜破裂时间<5 秒组和≥5 秒组之间的 MMP-9 等级均无显著差异（表 4）。

SD：标准差；MMP-9：基质金属蛋白酶-9。

3.3. 渗透压与眼表参数。渗透压与任何其他眼表参数 （包括 Schirmer 试验 I 结果、泪膜破裂时间（NIBUT） 和角膜染色评分）之间均无相关性（表 5 和图 1）。然而， 当我们根据干眼症的严重程度定性地将渗透压与眼表参 数组进行比较时（例如，角膜染色评分阳性/阴性、Schirmer 试验 I 结果<10/≥10 毫米、NIBUT<5/≥5 秒）， 角膜染色阳性组的渗透压值显著高于角膜染色阴性组 （分别为 321.6 ± 19.261 和 299.89 ± 16.213；p = 0.018） （表 4 和图 2）。然而，Schirmer 试验 I 结果<10 毫米组 与≥10 毫米组之间以及 NIBUT<5 秒组与≥5 秒组之间的 渗透压值无差异。

4. 讨论

干眼症通常难以诊断，有时甚至无法确诊，这是由于其 成因多样，且症状与常见的临床表现之间关联性较弱。

评估评估 [18 - 20]。然而，研究已证实炎症是与干眼症相 关的重要因素，并且人们已尝试使用炎症标志物和参数 来诊断干眼症 [5, 21, 22]。

MMP-9 是一种炎症标志物，在干眼症患者的泪液中 含量会升高[9, 23]。炎症激活了 MMP-9 的生成，从而触发炎症通路，例如应激激 活蛋白激酶（SAPK）信号级联反应，最终加剧炎症[24, 25]。MMP-9 在炎症期间参与角膜细胞外基质重塑[26, 27]；然而，它也可以通过裂解促炎因子前体来促进炎症[28, 29]；因此，MMP-9 可促进角膜细胞外基质降解和上 皮细胞损失[9, 30]。

1992 年，法里斯（Farris）[31] 认为泪液渗透压是诊断 干眼症的金标准，此后开展了多项针对干眼症患者泪膜 渗透压的研究。研究报道，高渗透压会激活炎症通路， 促进促炎细胞因子的释放，进而导致角膜上皮损伤和杯 状细胞丢失[32, 33]。

此外，炎症会降低泪膜的稳定性，并进一步增加渗透压[34, 35]。

在我们的研究中，MMP-9 等级与泪膜渗透压呈正相 关。先前的研究使用 InflammaDry 和 ELISA 评估了泪膜渗 透压与 MMP-9 之间的相关性，两者均报告称 MMP-9 与 泪膜渗透压无显著相关性[4]。然而，他们也提到，MMP9检测呈阳性结果与泪膜渗透压升高有关。因此，在病情 更严重的干眼症患者中，MMP-9 与渗透压之间可能存在 关联[4]。相反，其他研究的结果表明 MMP-9 与渗透压相 关。例如，Li 等人[13]研究了角膜上皮细胞，报告称随着 培养基渗透压的升高，MMP-9 的表达增加。与我们的结 果相似，VanDerMeid 等人[6]报告称从 Schirmer 条中提取 的 MMP-9 与泪液渗透压密切相关。泪液中的高渗透压可 触发 SAPK 通路，导致角膜上皮细胞释放 MMP-9，从而 引发炎症的逐渐加重[10, 25]。

在本研究中，MMP-9 与任何其他眼表参数（包括 Schirmer 试验 I、泪膜破裂时间（NIBUT）和角膜染色评 分）均无相关性。此前评估 MMP-9 与眼表参数相关性的 研究结果不一。例如，一些研究报道 MMP-9 与这些眼表 参数存在统计学上的显著相关性[1, 9]；然而，其他研究则 表明这些参数与 MMP-9 无相关性[4, 6, 36, 37]。

总体而言，MMP-9 与干眼症体征之间的相关性尚未明确确立；因此， 应开展进一步的研究来验证这种关系。 此外，先前评估泪膜渗透压与角膜染色评分之间相关 性的研究结果各不相同。例如，Mathews 等人[7]和 Kook 等人[37]报告称，较高的泪液渗透压与较高的角膜染色评 分相关，而其他研究则报告称泪液渗透压与角膜染色评分 无关[4, 38]。在我们的研究此外，炎症会降低泪膜的稳定性，并进一步增加渗透压[34, 35]。 在我们的研究中，MMP-9 等级与泪膜渗透压呈正相 关。先前的研究使用 InflammaDry 和 ELISA 评估了泪膜渗 透压与 MMP-9 之间的相关性，两者均报告称 MMP-9 与 泪膜渗透压无显著相关性[4]。然而，他们也提到，MMP9检测呈阳性结果与泪膜渗透压升高有关。因此，在病情 更严重的干眼症患者中，MMP-9 与渗透压之间可能存在 关联[4]。相反，其他研究的结果表明 MMP-9 与渗透压相 关。例如，Li 等人[13]研究了角膜上皮细胞，报告称随着 培养基渗透压的升高，MMP-9 的表达增加。与我们的结 果相似，VanDerMeid 等人[6]报告称从 Schirmer 条中提取 的 MMP-9 与泪液渗透压密切相关。泪液中的高渗透压可 触发 SAPK 通路，导致角膜上皮细胞释放 MMP-9，从而 引发炎症的逐渐加重[10, 25]。 在本研究中，MMP-9 与任何其他眼表参数（包括 Schirmer 试验 I、泪膜破裂时间（NIBUT）和角膜染色评 分）均无相关性。此前评估 MMP-9 与眼表参数相关性的 研究结果不一。例如，一些研究报道 MMP-9 与这些眼表 参数存在统计学上的显著相关性[1, 9]；然而，其他研究则 表明这些参数与 MMP-9 无相关性[4, 6, 36, 37]。总体而言，MMP-9 与干眼症体征之间的相关性尚未明确确立；因此， 应开展进一步的研究来验证这种关系。 此外，先前评估泪膜渗透压与角膜染色评分之间相关 性的研究结果各不相同。例如，Mathews 等人[7]和 Kook 等人[37]报告称，较高的泪液渗透压与较高的角膜染色评 分相关，而其他研究则报告称泪液渗透压与角膜染色评分 无关[4, 38]。在我们的研究

此外，在本研究中，Schirmer 试验结果和非侵入性泪 膜破裂时间（NIBUT）与泪膜渗透压之间无相关性。同样， 先前的研究也报告称，Schirmer 试验结果和泪膜破裂时间 与泪膜渗透压无显著相关性[4, 6, 7]。然而，最近 Park 等 人[39]报告称，通过 I-PEN 测量的泪液渗透压与泪膜破裂 时间和 Schirmer 试验呈负相关，而 Kook 等人[37]报告称， 泪液渗透压与泪膜破裂时间（BUT）和 Schirmer 试验呈负 相关。需要进一步的研究来解决这些报告之间的不一致。

过去，在临床环境中测量泪膜渗透压和基质金属蛋白 酶 9（MMP-9）较为困难。然而，如今 InflammaDry 和 TearLab 或 I-PEN 分别可用于临床环境中测量 MMP-9 和 泪膜渗透压。常见的临床体征和症状评估，如 Schirmer 试 验、泪膜破裂时间、角膜和结膜染色评分、睑板腺评估以 及眼表疾病指数（OSDI），并不总是与干眼症有很好的 相关性，这使得干眼症的诊断变得困难[18-20]。因此，在 临床实践中，补充评估炎症的测量指标，如 MMP-9 和泪 膜渗透压，有助于干眼症的诊断。

本研究受其回顾性研究设计和样本量较小的限制。此 外，对 MMP-9 分级的定量评估具有主观性，这也存在局 限性。因此，应开展样本量更大且 MMP-9 分级评估更客 观的前瞻性研究，以验证我们的结果。

5. 结论

基质金属蛋白酶 9（MMP-9）可能是泪膜渗透压的一个指 标，反之亦然。此外，渗透压可能与干眼症患者的角膜染 色存在关联。总体而言，我们的研究结果表明，MMP-9 与泪膜渗透压之间存在关联。

评估可用于简便快捷地识别干眼症患者的炎症情况。

数据可用性

本研究中使用和分析的数据集可应合理要求向通讯作 者获取。

利益冲突

作者声明不存在利益冲突。

作者贡献

MJK、HSK、MSK 和 ECK 对研究概念和设计做出了 贡献；MJK 和 ECK 参与了数据收集；MJK 和 ECK 参 与了数据的分析和解读；MJK 和 ECK 参与了论文撰写；MJK、HSK、MSK 和 ECK 参与了论文的审校；MJK 和 ECK 提供了统计学方面的专业知识；MJK 提供了行 政、技术或物质支持；ECK 负责监督工作。

致谢

本研究得到了韩国国家研究基金会（NRF）基础科学 研究计划的支持，并由韩国教育部资助（2018R1D1A1 A02085334）。

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